蛍光免疫染色〜研究室級〜/はじめての染色体

試薬
・微小管固定バッファー（MTSB）
　作り方：
　1. 1.5 g PIPES, 0.19 g EGTA, 0.13 g MgSO4 7H2Oおよび0.5 g KOHを800 mlの蒸留水に溶かす。
　2. KOHを使ってpHを7.0に調整する。
　3. 蒸留水により液量を1000 mlに調整する。

・3% (w/v) パラフォルムアルデヒド in MTSB（４℃保存。実験には調整後１週間以内のものを用いる。廃液は、フォルマリン廃液として処理する。）
　作り方：
　1. 10 mlのMTSBを80℃に温める。
　2. 0.3 g パラフォルムアルデヒドを加え、沸騰しないように溶かす（湯煎が望ましい。ドラフト内で行う）。

・10 x PBS緩衝液
　作り方：
　1. 80 g NaCl, 2 g KCl, 35.8 g Na2HPO4 12H2Oおよび2.4 g KOHを800 mlの蒸留水に溶かす。
　2. HClを使ってpHを7.4に調整する。
　3. 蒸留水により液量を1000 mlに調整する。

・PBS緩衝液
　作り方：
　1. 10 x PBS緩衝液を蒸留水で10倍希釈する。

・1% (w/v) cellulase, 0.5% (w/v) pectolyase in PBS buffer（-20℃保存）
　作り方：
　1. 0.1 g Cellulase Onozuka RS （ヤクルト薬品工業）および50 mg Pectolyase Y-23（盛進製薬）を10 mlのPBS緩衝液に溶かす。

・4 x TNB（-20℃保存）
　作り方：
　1. 4 ml 1 M Tris-HCl (pH7.5), 0.35 g NaCl, 0.2 g Blocking reagent（Roche）を4 mlの蒸留水に加える。
　2. 沸騰しないように温めながら溶かす（湯煎が望ましい）。
　3. 蒸留水で10 mlにメスアップする。

・１次抗体反応液（保存不可）
　作り方：
　1. 4 x TNBを蒸留水で４分の１に希釈し、スライドあたり100 μlのTNB溶液を作る。
　2. ウサギ抗AfiCENH3抗体およびマウス抗αチューブリン抗体（SIGMA T6199）を1 μlずつ加える。

・２次抗体反応液（保存不可）
　作り方：
　1. 4 x TNBを蒸留水で４分の１に希釈し、スライドあたり100 μlのTNB溶液を作る。
　2. 抗ウサギAlexa Fluor 555抗体（Invitrogen）と抗マウスAlexa Fluor 488抗体（Invitrogen）を1 μlずつ加える。

・Prolong antifade gold（Invitrogen）

器具
・PLLコートスライドガラス（MASTUNAMI S7441等）
・ピンセット・安全カミソリ
・濾紙・24 x 40 mmカバーガラス
・染色瓶
・25 x 25 mmパラフィルム
・湿箱（プラスチック容器にスノコを入れたもの。写真参照）


実験操作（Nagaki et al. 2004 & 2012に基づく）
1. 2 cm程度に切断した根端を 3% (w/v) パラフォルムアルデヒド in MTSB中、室温で20分間固定する。
2. 溶液を取り除き（フォルマリン廃液として処理すること）、PBS緩衝液で10分間ずつ２回洗浄する。
3. 根端分裂組織を切り出し、1% (w/v) cellulase, 0.5% (w/v) pectinase in PBS buffer中、37℃で１時間処理する。
4. 溶液を取り除き、PBS緩衝液で10分間ずつ２回洗浄する。
5. スライド１枚あたり5 μlのPBS緩衝液を加え、消化された根端分裂組織を緩衝液に懸濁する。
6. PLLコートスライドガラスに5 μlの懸濁液を載せる。
7. 24 x 40 mmカバーガラスを図のように十字状にかぶせ、濾紙に挟み込み押しつぶす。

8. カバーガラスをはぎ取り、スライドを染色瓶中のPBS緩衝液に浸ける。
9. 100 μlの１次抗体反応液をスライド上のサンプルに加え、25 x 25 mmに切断したパラフィルムで被う。
10. スライドを蒸留水を入れた湿箱に入れて、4℃で一晩反応させる。
11. パラフィルムを取り除き、 スライドを染色瓶中でPBS緩衝液により洗浄する（３回）。
12. 100 μlの２次抗体反応液をスライド上のサンプルに加え、25 x 25 mmに切断したパラフィルムで被う。
13. スライドを蒸留水を入れた湿箱に入れて、37℃で１時間反応させる。
14. パラフィルムを取り除き、スライドを0.1 μg/ml DAPI in PBS bufferに10分間浸ける。
15. スライドを染色瓶中でPBS緩衝液により洗浄する。 スライドを染色瓶中で蒸留水により洗浄する（３回）。
16. 37℃でスライドを乾燥させる。
17. 5 μlのProlong antifade gold（Invitrogen）をスライド上のサンプルに載せ、カバーグラスでカバーする。
18. 37℃で30分間インキュベートする。
19. 蛍光顕微鏡もしくは共焦点レーザー顕微鏡で観察する。