組織免疫染色〜先端研究室級〜/はじめての染色体

試薬
・微小管固定バッファー（MTSB）
　作り方：
　1. 1.50 g PIPES, 0.19 g EGTA, 0.13 g MgSO4 7H2Oおよび0.50 g KOHを800 mlの蒸留水に溶かす。
　2. KOHを使ってpHを7.0に調整する。
　3. 蒸留水により液量を1000 mlに調整する。

・3% (w/v) パラフォルムアルデヒド in MTSB（４℃保存。実験には調整後１週間以内のものを用いる。廃液は、フォルマリン廃液として処理する。）
　作り方：
　1. 10 mlのMTSBを80℃に温める。
　2. 0.3 g パラフォルムアルデヒドを加え、沸騰しないように溶かす（湯煎が望ましい。ドラフト内で行う）。

・10 x PBS緩衝液
　作り方：
　1. 80 g NaCl, 2 g KCl, 35.8 g Na2HPO4 12H2Oおよび2.4 g KOHを800 mlの蒸留水に溶かす。
　2. HClを使ってpHを7.4に調整する。
　3. 蒸留水により液量を1000 mlに調整する。

・PBS緩衝液
　作り方：
　1. 10 x PBS緩衝液を蒸留水で10倍希釈する。

・5% (w/v) 低融点寒天 in PBS buffer
　作り方：
　1. 0.5 g 低融点寒天を10 mlのPBS緩衝液に溶かす。

・ 0.1% (w/v) pectolyase and 0.3% (v/v) Triton X-100 in PBS
　作り方：
　1. 10 mg Pectolyase Y-23（盛進製薬）を10 mlのPBS緩衝液に溶かす。
　2. 30 μlのTriton X-100を加える。

・5% (w/v) BSA in PBS
　作り方：
　1. 0.5 g BSAを10 mlのPBS緩衝液に溶かす。

・１次抗体反応液（保存不可）
　作り方：
　1. 目的の１次抗体を適切な濃度になるように、１穴あたり150 μlのPBS緩衝液に加える　（適正濃度が不明な場合は、1/100希釈から試してみる）。

・２次抗体反応液（保存不可）
　作り方：
　1. ２次抗体を適切な濃度になるように、１穴あたり150 μlのPBS緩衝液に加える。　（Alexa Fluor抗体の場合は1/300〜3000希釈が良い）。

器具
・Microslicer (LinearSlicer PRO10; Dosaka EM)
・ 疎水性コートスライドガラス（MATSUNAMI SF17380等）
・22 x 22 mmカバーガラス
・湿箱（プラスチック容器にスノコを入れたもの。写真参照）


実験操作（Yamaji & Ma 2007を改変）
1. 2 cm程度に切断した根端を 3% (w/v) パラフォルムアルデヒド in MTSB中、室温で20分間固定する。
2. 溶液を取り除き（フォルマリン廃液として処理すること）、PBS緩衝液で10分間ずつ２回洗浄する。
3. シャーレ中、40℃の5% (w/v) 低融点寒天 in PBS bufferに根を沈め包埋する。
4. 4℃で寒天を硬化させる。
5. Microslicer (LinearSlicer PRO10; Dosaka EM)を用いて、厚さ100 μmの切片を切り出す。
6. 疎水性コートスライドガラスの上に保持したPBS緩衝液中に切り出した切片を浮かべる。

7. PBS緩衝液を取り除き、150 μlの0.1% (w/v) pectolyase and 0.3% (v/v) Triton X-100 in PBSを加える。
8. スライドを湿箱中、30℃で2時間保温する。
9. 酵素液を取り除き、300 μlのPBS緩衝液により洗浄する（３回）。
10. 150 μlの5% (w/v) BSA in PBSを加え、室温で10分間ブロッキングする。
11. ブロッキング液を取り除き、150 μlの１次抗体を含むPBS緩衝液を加える。
12. スライドを湿箱中、室温で一晩保温する。
13.１次抗体液を取り除き、300 μlのPBS緩衝液により洗浄する（３回）。
14. 150 μlの5% (w/v) BSA in PBSを加え、室温で10分間ブロッキングする。
15. ブロッキング液を取り除き、150 μlの２次抗体を含むPBS緩衝液を加える。
16. スライドを湿箱中、室温で２時間保温する。
17. ２次抗体液を取り除き、DNA染色色素（0.1 μg/ml DAPI等）を含むPBS緩衝液 300 μl により10分間染色する。
18. 染色液を取り除き、300 μlのPBS緩衝液により洗浄する（３回）。
19. 10 μlの退色防止剤を加え、22 x 22 mm カバーガラスをかぶせる。
20. カバーガラスの４辺とスライドガラス間の隙間をマニュキアにより封印する。
21. 共焦点レーザー顕微鏡により観察する。